生物化學實驗-(第二版) 節選

nbsp;   言
    1993年，原國家醫藥管理局科技教育司鑒于我國藥學高等專科教育一直沒有進行
全國性的教材建設，根據國家教委(1991)25號文的要求負責組織、規劃高等藥學專科
教材的編審出版工作。在國家教委的指導下，在對全國高等藥學專科教育情況調查的基
礎上，普通高等專科教育藥學類教材建設委員會于1993年底正式成立，并立即制訂了
“八五”教材編審出版規劃。1995年，經100多位專家組、編寫組教師和中國醫藥科技
出版社的團結協作、共同努力，建國以來**套普通高等專科教育藥學類規劃教材終于
面世了。其后，又根據高等藥學專科教育的主要任務是為醫藥行業生產、流通、服務、
管理**線培養應用型技術人才的需要，立即組織編審、出版了相關的配套教材(實驗
指導、習題集)，以加強對學生的實驗教學，培養學生的實際操作能力。
    該套規劃教材是國家教委“八五”教材建設的一個組成部分。從當時高等藥學專科
教育的現實情況考慮，統籌規劃、全面組織教材建設活動，為優化教材編審隊伍，確保
教材質量，規范教材規格，起到了至關重要的作用。也正因為如此，這套規劃教材受到
了藥學專科教育的大多數院校的追崇及廣大師生的喜愛，其使用情況一直作為全國高等
藥學專科教育教學質量評估的基本依據之一，可見這套教材的影響之大。
    由于我國的高等教育近年進行了一系列改革，我國藥學高等專科教育變化也較大，
加之教學大綱的不斷調整，這套教材已不能滿足現在的教學需要，亟需進行修訂。但
是，因為原主管部門已不再管理我國藥學高等專科教育，加之一些高等藥學專科學校已
經合并到其他院校，原普通高等專科教育藥學類教材建設委員會已不能履行修訂計劃。
因此，全國高等醫藥院校藥學類教材編輯委員會接管了這項工作，組成了新的普通高等
專科教育藥學類教材建設委員會，組織了這套規劃教材的修訂，希望修訂后的這套規劃
教材能夠適應當前高等藥學專科教育發展的需求。在修訂過程中，考慮到高等專科教育
中全日制教育、函授教育、自學考試等多種辦學形式，力求使這套教材能具有通用性，
以適應不同辦學形式的教學要求。學術是有繼承性的，雖然**版的一些作者已經退休
或因為其他原因離開了藥學高等專科教育崗位，不能繼續參加這套教材的修訂工作，但
是他們對這套教材做出了非常重大的貢獻，在此，我們謹對他們表示衷心的感謝。
    這套規劃教材修訂出版后，竭誠歡迎使用本教材的廣大讀者提出寶貴意見，以便我
們進行教材評優工作，不足之處我們將在以后修訂時改正。
    全國普通高等專科教育
    藥學類規劃教材建設委員會
    2003年12月
實驗四sDs一聚丙烯酰胺凝膠電泳法
    測宦蛋白質分子量
    【目的】
    1．掌握SDS—PAGE測定蛋白質分子量的基本原理。
    2．熟悉垂直板型電泳的基本操作技術。
    3．了解標準曲線的制作以及測定蛋白質分子量的方法。
    【原理】
    蛋白質在電場中支持物上的遷移率差異主要取決于樣品中各種分子攜帶的電荷、分
子的大小與形狀的差別。要利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)測定某一物質的分子量，
必須排除電荷、分子形狀等因素或使其作用減少到忽略不計的程度，使該物質遷移率的
大小僅僅取決于其分子量的大小。
    1967年，Shapiro等人發現，如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統中加入陰離子去垢劑
十二烷基硫酸鈉(SDS)后，蛋白質的遷移率將主要取決于其分子量的大小。SDS是一
種陰離子去垢劑，在溶液中能與蛋白質分子的疏水部分定量結合，把多亞基蛋白質拆成
亞單位，并帶上陰離子。這些陰離子掩蓋了蛋白質分子本身所帶的電荷差異，所以
SDS一聚丙烯酰胺電泳(SDS—PAGE)消除了電荷效應，只有分子篩效應，故蛋白質電
泳遷移率完全取決于分子量，遷移率與分子量對數呈線性關系。即可從標準曲線上求得
蛋白質的近似分子量。
【器材】
1．電泳儀
2．垂直板狀電泳槽及膠板裝置
3．細長頭滴管
4．微量加樣器和吸頭
5．帶長針頭微量注射器
6．1．5ml的離心管
7．不銹鋼藥鏟
8．小燒杯和大培養皿
9．濾紙和尺子
 【試劑】
    1．凝膠貯備液
    稱取丙烯酰胺(Acr)30g，甲叉丙烯酰胺(Bis)0．8g，加蒸餾水溶至100ml，用三
號濾紙過濾，于棕色瓶中413保存，一般可用1個月。
    2．分離膠緩沖液
    稱取三羥甲基氨基甲烷(Tris)36．3g，lmol／L HCl溶液48ml，加雙蒸餾水
(ddH20)至80ml使其溶解，調pH至8．9，然后用ddH20稀釋至100ml，置棕色瓶中，
4C貯存。
    3．濃縮膠緩沖液    一
    取Tris堿5．98g，lmol／L HCl溶液48ml，加ddH20至80mi，調pH 6．7，用ddH20
稀釋至100ml，置棕色瓶中，4C保存。
    4．Tris一甘氨酸電極緩沖液
    稱取’Dis 6．0g、甘氨酸28．8g，加ddH20 850ml，調pH至8．3，加ddH20定容至
1000ml，4。C貯存。用時可作10倍稀釋。
    5．10％過硫酸銨
    稱取過硫酸銨0．5g，加ddH20 5mi，貯于4C保存。
    6．TEMED【四甲基Z,--胺)
    7．10％SDS
    稱取SDS 1g，加蒸餾水10ml使其溶解。   
    8．上樣緩沖液
    取濃縮膠緩沖液6．25ml、蔗糖10g、SDS 2．0g、溴酚藍0．1g，甘油20ml，加ddH20
定容至100ml。
    9．考馬斯亮藍染色試劑
    (1)考馬斯亮藍R250染色液濃度為2．5g／L，用甲醇：醋酸：蒸餾水=5：l：5的溶
液配制(V／V)。
    (2)考馬斯亮藍脫色液取冰醋酸7．5ml、甲醇5mi，加ddH20至100mlo
    10．樣品和分子量標準蛋白
    樣品為人血清。分子量標準蛋白可用細胞色素C、肌紅蛋白、γ一球蛋白、碳酸酐
酶、卵白蛋白、白蛋白(人)和轉鐵蛋白(人)等。
    【操作】    。
    1．玻璃板的準備
    將玻璃板洗滌干凈，固定于電泳槽上，0．8％瓊脂糖密封邊緣。
    2．電泳凝膠制備
    (1)分離膠的制備取凝膠貯備液4．9ml，分離膠緩沖液2．5ml，蒸餾水12．25ml，
10％SDS 0．2ml，TEMED 0．05ml，10％過硫酸銨溶液0．1ml，混勻。立即用細長頭的滴
管將凝膠溶液加于玻璃板間，上部用ddH20或30％乙醇(約3～4mm)封面，保持膠面
平整，室溫下靜置約30～60min。待分離膠凝固后，可看到清晰的膠水界面。此膠濃度
為2．6％。
    (2)濃縮膠的制備用濾紙吸去分離膠上層多余的水，但不要碰破膠面。再用注射
器取濃縮膠緩沖液洗滌膠面數次，即可制備濃縮膠。
    取凝膠貯備液lml，濃縮膠緩沖液1．25ml、ddIH2O120 7．5ml、10％SDS 0．1ml、
TEMED 0．05ml、10％過硫酸銨0．1ml，混勻后，立即用細長頭滴管將凝膠溶液加到分離
膠的上方，直至距玻璃板上緣約0．5cm處，再輕輕插入樣品梳，靜置40min，使其充分
聚合，此膠濃度為2．6％。凝膠聚合后，小心拔去梳子，用去離子水沖洗梳孔以除去未
聚合的丙烯酰胺。在兩電極槽中加入10倍稀釋的電極緩沖液，即可上樣電泳。
    3．樣品預處理和加樣
    取血清0．1ml、上樣緩沖液0．9ml，混勻，在沸水中煮沸5min。用微量注射器將樣
品加到梳孔中，上樣量一般5～20μl。用同樣方法處理已知分子量的標準蛋白質后用微量
注射器依次將樣品加到各梳孔，對于未使用的梳孔，*好加上上樣緩沖液。
    4．電泳
    上槽接負極，下槽接正極，調電壓為8V／cm凝膠(30～50V)，開始電泳，當待測樣
在濃縮膠部分濃縮成一條線后，將電壓增加到15V／cm凝膠(60～100V)，繼續電泳直至
染料抵達距分離膠下端約1cm處，停止電泳，斷開電源。
    5．考馬斯亮藍11250染色
    電泳結束后，取出電泳膠模，移去固定框，用不銹鋼藥鏟輕輕將一塊玻璃板撬開移
去，在膠板一端切除一角作為標記，將膠板移至大培養皿中。精確量取并記錄分離膠膠
長度和指示染料的遷移距離(分離膠上緣到染料條帶中心距離)。然后將凝膠板浸入考馬
斯亮藍染色液中染色1h，再用脫色液脫色1～2天，直至背景無色為止。
    6．校正曲線的數據處理和分子量測定
    精確量取并記錄染色后凝膠長度、各已知分子量標準的蛋白質和各待測蛋白質區帶的
  遷移距離(分離膠上緣到各蛋白質區帶中心)。按下式計算各蛋白質的相對遷移率(Rf值)：
      蛋白質染色區帶遷移距離×染色前凝膠的長度
    kf一  指示染料的遷移距離×染色后凝膠的長度
    分別求得已知分子量標準的蛋白質和樣品蛋白質的Rf值后，在半對數紙上，以分子
  量的對數為縱坐標、以各標準蛋白質的Rf值為橫坐標作圖，可得一條分子量標準曲線。
  根據各待測蛋白質的Rf值，查此曲線，可求得各待測蛋白質的相對分子量(表3—3)。
表3—3標準蛋白分子量及對數值